1

Tên nhiệm vụ: Nghiên cứu mối liên quan giữa nồng độ và tính đa hình gen của một số dấu ấn sinh học với chỉ số lipid máu và kháng insulin ở bệnh nhân đái tháo đường type 2 tại các bệnh viện trên địa bàn Hà Nội

2

3

4

Mã số nhiệm vụ (nếu có): 01C-08/04-2020-3

5

Tên tổ chức chủ trì: Học viện Quân y

6

Cơ quan chủ quản: Bộ Giáo dục và Đào tạo

7

Chủ nhiệm nhiệm vụ: TS, BS Bùi Khắc Cường

8

Danh sách cá nhân tham gia nhiệm vụ: PGS,TS.BS Cấn Văn Mão TS. BS. Đặng Thành Chung GS. TS. Nguyễn Lĩnh Toàn PGS. TS. Hồ Anh Sơn TS. Hoàng Văn Tổng PGS. TS. Huỳnh Quang Thuận TS. BS. Nguyễn Thị Mai Ly

9

Mục tiêu nghiên cứu:

10

Tóm tắt nội dung nghiên cứu chính: Nội dung 1: Nghiên cứu tổng quan
Nội dung 2: Thông qua hội đồng đạo đức trong nghiên cứu.
Nội dung 3: Nghiên cứu đánh giá các thông tin lâm sàng, cận lâm sàng của bệnh nhân đái tháo đường type 2 và nhóm đối chứng.
Nội dung 4: Nghiên cứu xác định nồng độ ANGPTL3, Metrnl và  FSP27 trong huyết tương của bệnh nhân đái tháo đường type 2 và nhóm đối chứng bằng kỹ thuật ELISA.
Nội dung 5: Nghiên cứu xác định tính đa hình gen đơn nucleotid của các gen mã hóa các protein ANGPTL3, Metrnl và  FSP27 của bệnh nhân đái tháo đường type 2 và nhóm đối chứng.
Nội dung 6: Nghiên cứu đánh giá mối liên quan giữa nồng độ ANGPTL3, Metrnl và  FSP27 với tình trạng bệnh lý đái tháo đường, rối loạn chuyển hóa Lipid và kháng Insuline của bệnh nhân đái tháo đường type 2
Nội dung 7:     Nghiên cứu đánh giá mối liên quan giữa tính đa hình gen mã hóa ANGPTL3, Metrnl và  FSP27 với tình trạng bệnh lí đái tháo đường, rối loạn chuyển hóa Lipid và kháng Insulin của bệnh nhân
Nội dung 8: Nghiên cứu đánh giá mối liên quan giữa tính đa hình gen mã hóa ANGPTL3, Metrnl và  FSP27 với mức độ biểu hiện của các protein này.

11

Lĩnh vực nghiên cứu: Khoa học y, dược

12

Mục tiêu kinh tế xã hội của nhiệm vụ:

13

Phương pháp nghiên cứu: Phương pháp ELISA
            Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme (ELISA) là một xét nghiệm sinh hóa phân tích thường được sử dụng, lần đầu tiên được mô tả bởi Engvall và Perlmann vào năm 1971. Xét nghiệm sử dụng xét nghiệm miễn dịch enzyme pha rắn (EIA) để phát hiện sự hiện diện của phối tử (thường là protein) trong mẫu chất lỏng sử dụng kháng thể chống lại protein cần đo. ELISA đã được sử dụng như một công cụ chẩn đoán trong y học, bệnh lý thực vật và công nghệ sinh học, cũng như kiểm tra kiểm soát chất lượng trong các ngành công nghiệp khác nhau.
            Ở dạng đơn giản nhất của ELISA, các kháng nguyên từ mẫu được gắn vào một bề mặt. Sau đó, một kháng thể phù hợp được áp dụng trên bề mặt để nó có thể liên kết với kháng nguyên. Kháng thể này được liên kết với một enzyme và trong bước cuối cùng, một chất có chứa chất nền của enzyme được thêm vào. Phản ứng tiếp theo tạo ra tín hiệu có thể phát hiện, phổ biến nhất là sự thay đổi màu sắc.
            Thực hiện ELISA cần ít nhất một kháng thể có tính đặc hiệu cho một kháng nguyên cụ thể. Mẫu có lượng kháng nguyên không xác định được cố định trên giá đỡ rắn (thường là tấm microtiter polystyrene). Sau khi kháng nguyên được cố định, kháng thể phát hiện được thêm vào, tạo thành một phức hợp với kháng nguyên. Kháng thể phát hiện có thể được liên kết cộng hóa trị với một enzyme hoặc chính nó có thể được phát hiện bởi một kháng thể thứ cấp được liên kết với một enzyme thông qua phản ứng sinh học. Giữa mỗi bước, tấm thường được rửa bằng dung dịch chất tẩy nhẹ để loại bỏ bất kỳ protein hoặc kháng thể nào không liên kết. Sau bước rửa cuối cùng, tấm được phát triển bằng cách thêm chất nền enzyme để khuếch đại tín hiệu, cho biết số lượng kháng nguyên trong mẫu.
Phương pháp tách chiết DNA tổng số
            Nguyên tắc: Phá vỡ cấu trúc mô, tế bào bằng biện pháp cơ học và hóa học (các chất tấy mạnh là NaOH và SDS) để giải phóng ra phức hợp nucleoprotein. Biến tính phức hợp nucleoprotein bằng các dung môi hữu cơ phenol: chloroform: isoamyl alcohol để giải phóng ra DNA. DNA được tủa bằng isopropanol và thu lại bằng ly tâm.
            Quy trình: Cặn tế bào được lưu trong ống Eppendorf 1,5 mL chứa 300 µL dung dịch ly giải tế bào (200 mM NaOH, SDS 2%).
Ủ ở 95^oC trong 15 phút sau đó trung hòa bằng 300 µL 1M Tris-HCl pH 4.
Bổ sung 1µg proteinase K và tiếp tục ủ ở 56^oC, 45 phút.
Bổ sung 600 µL dung môi 25:24:1 để phân tách DNA tổng số.
Ly tâm với tốc độ 10000 g trong 15 phút.
Hút thu dịch pha trên chứa DNA chuyển sang ống eppendorf 1,5 mL mới.
Kết tủa dịch chứa DNA bằng isopropanol theo tỉ lệ 1:1.
Ly tâm lạnh 40C với tốc độ 12000 rpm trong 20 phút.
Hút bỏ dịch nổi, bổ sung 700 µL Ethanol 75% để rửa kết tủa DNA.
Ly tâm lạnh 4^oC với tốc độ 12000 g trong 5 phút.
Hút bỏ ethanol để thu cặn DNA.
Ly tâm cặn DNA với tốc độ 12000 rpm trong 1 phút và dùng pipet loại bỏ ethanol còn sót lại ở đáy ống (chú ý không được làm khô bằng speedvac) và để khô tự nhiên trong 10 phút.
Bổ sung 200 µL TE (20 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA) vào cặn DNA, ủ
56^oC trong  10 phút để hòa tan cặn DNA.
Đo nồng độ DNA, đánh giá chất lượng DNA (thông qua chỉ số OD260/OD280).
Bảo quản trong tủ lạnh - 20^oC.
Phương pháp đo quang phổ kế xác định nồng độ, độ tinh sạch DNA
            Xác định hàm lượng DNA (hoặc RNA) trong dung dịch phân tích dựa vào mức độ hấp thụ cực đại ánh sáng tia tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các base nitơ trong các axit nucleic. Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm của các mẫu đo cho phép xác định nồng độ axit nucleic trong mẫu dựa vào mối tương quan:
            1 đơn vị OD₂₆₀ nm dung dịch DNA sợi đôi = 50 µg/mL
            1 đơn vị OD₂₆₀ nm dung dịch DNA sợi đơn = 20-33 µg/mL
            1 đơn vị OD₂₆₀ nm dung dịch RNA = 40µg/mL
            Hàm lượng DNA sợi đôi được xác định bằng công thức:
            (DNA)= OD₂₆₀ × 50 × X (µg/mL)
            Trong đó X là số lần pha loãng từ dung dịch DNA ban đầu.
            Phương pháp này có thể xác định được độ sạch mẫu phân tích dựa trên tỉ số OD₂₆₀/OD₂₈₀. Mẫu DNA tinh sạch có tỉ số OD₂₆₀/OD₂₈₀ ≈ 1.8; Mẫu RNA tinh sạch sẽ có tỉ số OD260/OD280 ≈  2. Do đó mẫu DNA/RNA đem phân tích có giá trị chấp nhận được trong khoảng từ 1.8 – 2. Nếu mẫu phân tích có tỉ số OD₂₆₀/OD₂₈₀ thấp hơn 1.8 thì có thể mẫu phân tích có các thành phần protein, phenol hoặc các chất mà hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại có bước sóng gần với 280nm hoặc 280nm.
Phương pháp Realtime PCR xác định tính đa hình SNP
Phương pháp Realtime PCR xác định tính đa hình SNP là phép đo các biến thể di truyền của đa hình đơn nucleotide (SNPs) giữa các cá thể của một loài. Đây là một phương pháp xác định kiểu gen. SNP là một trong những loại biến thể di truyền phổ biến nhất. SNP là một biến đổi cặp bazơ đơn tại một locus cụ thể, thường bao gồm hai alen (trong đó tần số alen hiếm là> 1%). SNP được phát hiện có liên quan đến nguyên nhân của nhiều bệnh ở người và đang trở nên đặc biệt quan tâm đến dược động học. Do SNP được bảo tồn trong quá trình tiến hóa, chúng đã được đề xuất làm chất đánh dấu để sử dụng trong phân tích định lượng các đặc tính của locus. SNP cũng có thể cung cấp dấu vân tay di truyền để sử dụng trong kiểm tra danh tính.  Sự gia tăng sự quan tâm đến SNPs đã được phản ánh bởi sự phát triển mạnh mẽ của một loạt các phương pháp xác định kiểu gen SNP. Các đoạn DNA được khuếch đại tại các vị trí xác định với các cặp primers đặc trưng. Tính đa hình gen được xác định dựa trên các probes được thiết kế để nhận biết từng SNP. Phương pháp Realtime PCR đặc hiệu allele cho phép xác định tính đa hình gen ở các vị trí khác nhau. Phương pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Tuy nhiên, áp dụng phương pháp này chỉ đánh giá được đặc điểm đa hình ở một vị trí cho một phản ứng PCR.
Phương pháp giải trình tự gene Sanger (Sanger sequencing)
            Giải trình tự Sanger là một phương pháp giải trình tự DNA được thương mại hóa lần đầu tiên dựa trên sự kết hợp có chọn lọc của dideoxynucleotide kết thúc chuỗi bởi DNA polymerase trong quá trình sao chép DNA in vitro. Được phát triển bởi Frederick Sanger và các đồng nghiệp vào năm 1977, đây là phương pháp giải trình tự được sử dụng rộng rãi nhất trong khoảng 40 năm.         Phương pháp giải trình tự Sanger dựa trên nguyên tắc thành phần phản ứng khuếch đại gene có bổ sung 4 loại ddNTP (dideoxynucleotide triphosphate) bao gồm ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP được đánh dấu bằng 4 chất màu huỳnh quang khác nhau. Khi các ddNTP liên kết vào phân tử DNA đang được tổng hợp sẽ làm ngừng phản ứng do không tạo được liên kết phosphodieste. Sản phẩm khuếch đại DNA được điện di và các tín hiệu huỳnh quang được máy giải trình tự hiển thị thành dãy băng màu huỳnh quang tương ứng với trình tự các nucleotide.
            Phương pháp chấm dứt chuỗi cổ điển đòi hỏi một mẫu DNA chuỗi đơn, mồi DNA, DNA polymerase, deoxynucleotidetriphosphate (dNTPs) và di-deoxynucleotidetriphosphate (ddNTPs) đã được sửa đổi. Các nucleotide kết thúc chuỗi này thiếu nhóm 3'-OH cần thiết cho sự hình thành liên kết phosphodiester giữa hai nucleotide, khiến DNA polymerase ngừng kéo dài DNA khi kết hợp ddNTP biến đổi. Các ddNTP có thể được gắn huỳnh quang để phát hiện trong các máy giải trình tự tự động.
            Mẫu DNA được chia thành bốn phản ứng giải trình tự riêng biệt, chứa cả bốn loại deoxynucleotide tiêu chuẩn (dATP, dGTP, dCTP và dTTP) và DNA polymerase. Đối với mỗi phản ứng chỉ được thêm vào một trong bốn dideoxynucleotide (ddATP, ddGTP, ddCTP hoặc ddTTP), trong khi các nucleotide khác được thêm vào là những loại thông thường. Nồng độ dideoxynucleotide phải thấp hơn khoảng 100 lần so với nồng độ deoxynucleotide tương ứng (ví dụ: 0,005mM ddTTP: 0,5mM dTTP) để cho phép tạo ra đủ các đoạn trong khi vẫn sao chép chuỗi hoàn chỉnh. Sau các vòng kéo dài DNA mẫu từ mồi được liên kết, các đoạn DNA kết quả được biến tính nhiệt và phân tách bằng kích thước bằng cách sử dụng điện di. Kết quả của quá trình giải trình tự sẽ cung cấp trình tự của đoạn DNA quan tâm, từ đó đặc điểm đa hình đơn nucleotid sẽ được đánh giá dựa trên trình tự thu được. Do tỉ lệ của các đa hình gen hiếm thường rất thấp, cho nên sự kết hợp hai phương pháp Real-time PCR và giải trình tự gen cho phép đánh giá tính đa hình ở hai vị trí khác nhau giúp cho việc đánh giá mối liên quan giữa tính đa hình và sự biểu hiện của các protein này với các chỉ số rối loạn lipid máu và kháng insulin.

14

Sản phẩm khoa học và công nghệ dự kiến:

15

Địa chỉ và quy mô ứng dụng dự kiến: Kết quả của nghiên cứu có thể áp dụng thực hiện tại bệnh viện cấp thành phố hoặc cấp tỉnh trên toàn quốc.

16

Thời gian thực hiện: 24 tháng (từ 01/10/2020 đến 01/09/2022)

17

Kinh phí được phê duyệt: 0 triệu đồng
trong đó:

18

Quyết định phê duyệt: số Số 4969/QĐ - UBND ngày 05 tháng Tháng 11 năm 2020

19

Hợp đồng thực hiện: số ngày 01 tháng Tháng 1 năm 1970