Mục tiêu tổng quát: Sản xuất được 5 kháng nguyên tái tổ hợp NS1 có hoạt tính, trong đó 4 kháng nguyên của DENV và 1 của ZKV.

Mục tiêu cụ thể: Để đạt được mục tiêu chính nói trên, đề tài cần đạt được các mục tiêu cụ thể như sau:

• • Sản xuất được gen mã hoá protein NS1 của bốn tuýp DENV, JEV và ZKV, tối ưu để biểu hiện ở E. coli và biểu hiện ở nấm men S. cerevisiae
  • Sản xuất và tinh chế NS1 tái tổ hợp ở dạng tinh khiết cao, có hoạt tính thông qua xét nghiệm Western blot và ELISA với mẫu bệnh phẩm

Kết quả thực hiện: Xác định được trình tự liên ứng của 4 tuýp virus Dengue (DENV1-4) và virus Zika phổ biến nhất trên toàn cầu. Các gen nói trên đã được biến nạp vào các chủng E. coli như BL21, M15, Rosetta nhằm khảo sát vật chủ tối ưu. Kết quả cho thấy BL21 là vật chủ tối ưu nhất để sản xuất NS1. Không thể biểu hiện các NS1 ở E. coli dưới dạng hoà tan mà cần tiến hành biểu hiện NS1 dưới dạng thể vùi, sau đó tái gập cuộn. Xác định được điều kiện biểu hiện tối ưu NS1 ở E. coli là nhiệt độ biểu hiện 15^oC, tốc độ lắc 200 vòng/phút, OD600 nằm trong khoảng 0,5-0,7 và nồng độ chất cảm ứng IPTG là 0,5 mM. Xác định được điều kiện tinh sạch tối ưu cho từng loại NS1 tái tổ hợp bằng cột sắc ký Ni-NTA trong điều kiện biến tính. Mức độ sạch của NS1 tinh chế đạt từ 93%-96%. Đã xác định được điều kiện tái gập cuộn protein NS1 bằng phương pháp thẩm tích từng bước. Sản lượng NS1 sản xuất từ E. coli đạt từ 1,8 g- 3,6 g/L, tuy còn thấp nhưng do phương pháp ước lượng còn thiếu chính xác, giá trị này có thể tăng 20-30 lần. Kết quả phân tích khối phổ (LC-MS/MS) cho thấy protein tái tổ hợp NS1 chính là protein NS1 của 4 tuýp Dengue và virus Zika. Tạo dòng và biến nạp gen mã hoá NS1 của 4 tuýp virus Dengue và virus Zika vào chủng nấm men S. cerevisiae 2805 bằng vector episome yEPGDPprepro- DIT1. Xác định được sự biểu hiện của gen mã hoá NS1 ở các chủng nấm men tái tổ hợp biến đổi bằng kỹ thuật colony PCR, Western blot đối với protein nội bào và ngoại bào. Xác định được điều kiện biểu hiện tối ưu là nhiệt độ biểu hiện 20^oC, tốc độ lắc 200 vòng/phút và thời gian nuôi cấy 3 ngày. Xác định được phương pháp cô đặc mẫu từ dịch chiết ngoại bào của nấm men là cô mẫu bằng ammonium sulfate 80% bão hoà, sau đó thẩm tích loại muối trong đệm PBS pH 7,4. Xác định được phương pháp tối ưu để tinh sạch NS1 biểu hiện ngoại bào từ nấm men S. cerevisiae. Protein tinh chế đạt độ tinh khiết >95%. Thông qua phương pháp khối phổ xác nhận protein NS1 biểu hiện ở nấm men S. cerevisiae chính là của 4 tuýp Dengue và Zika. Sản lượng NS1 sản xuất ở S. cerevisiae đạt từ 0,2-0,22 mg/L với hiệu suất thu hồi đạt >70%. NS1 của 3 tuýp DENV1, DENV2 và DENV4 sản xuất từ E. coli và nấm men S. cerevisiae đều có khả năng nhận diện kháng thể đặc hiệu trong mẫu huyết thanh của bệnh nhân sốt xuất huyết, thông qua kỹ thuật xét nghiệm Western blot. NS1 của 3 tuýp DEN1, DENV 2 và DENV4 sản xuất từ E. coli và nấm men S. cerevisiae có khả năng phân biệt giữa huyết thanh của bệnh nhân âm tính và bệnh nhân dương tính, và có tiềm năng định tuýp. Kết luận này là tạm thời do số lượng mẫu sốt xuất huyết của chúng tôi chưa đủ độ đa dạng.