BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
HỆ THỐNG THÔNG TIN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

Lọc theo danh mục
  • Năm xuất bản
    Xem thêm
  • Lĩnh vực
liên kết website
Lượt truy cập
 Lượt truy cập :  14,873,254

62

Công nghệ sinh học

Vũ Thị Duy Ly; Trần Thị Xuân Giang; Ngô Thu Trang; Đinh Nho Thái; Phan Tuấn Nghĩa; Nguyễn Thị Hồng Loan; Nguyễn Thị Hồng Loan(1); 

Nhân dòng và biểu hiện 3 chymotrypsin-like protease của SARS-CoV-2 bằng vector pET28a ở E. coli

Cloning and Expression of 3 Chymotrypsin-like Protease of SARS-CoV-2 in E. coli using pET28a Vector

Tạp chí Khoa học tự nhiên và công nghệ – Đại học Quốc gia Hà Nội

2023

02

39-48

2615-9317

3 chymotrypsin-like protease; Protein tái tổ hợp; Gen pET28a; SARS-CoV-2

3 chymotrypsin-like protease; PET28a gene; Recombinant protein; SARS-CoV-2; Escherichia coli

3 chymotrypsin-like protease (3CLpro) của virus Corona gây hội chứng hô hấp cấp tính type 2 (SARS-CoV-2) cần thiết cho quá trình nhân lên và đóng gói của virus và được xem như một trong các đích quan trọng để ức chế hoạt động của virus. Trong nghiên cứu này, gen mã hóa cho 3CLpro (918 bp) của SARS-CoV-2 đã được nhân bản thành công từ cDNA của virus bằng PCR và được nhân dòng vào vector pGEM-T. Đoạn gen mã hóa cho 3CLpro sau đó được đưa vào vector biểu hiện pET28a ngay sau trình tự nucleotide của 6 gốc histidine để tạo ra dạng protein dung hợp 6xHis-3CLpro. Cấu trúc gen này đã được biểu hiện thành công trong tế bào E. coli. Các điều kiện thích hợp để biểu hiện 3CLpro bao gồm nhiệt độ nuôi cấy vi khuẩn E. coli tái tổ hợp ở 20 oC, cảm ứng bằng isopropyl thiogalactopyranoside (IPTG) 1,0 mM tại pha logarit khi mật độ tế bào (OD600) khoảng 0,7-0,8 và sinh khối được thu sau 24 giờ cảm ứng. 3CLpro tái tổ hợp đã được tinh sạch bằng cột sắc ký ái lực Ni-sepharose trong điều kiện biến tính, có kích thước khoảng 41 kDa trên điện di gel polyacrylamide có chứa sodium dodesyl suphate natri (SDS-PAGE), phản ứng đặc hiệu với kháng thể đa dòng kháng 3CLpro. 3CLpro tinh sạch sau khi hồi tính có hoạt tính phân cắt cơ chất đặc hiệu của 3CLpro.

The 3 chymotrypsin-like protease (3CLpro) of the severe acute respiratory syndrome coronavirus type 2 (SARS-CoV-2) is one of the primary targets for the development of antiviral drug therapies as it plays a critical role in viral replication. In this study, the gene encoding for SARS-CoV-2 3CLpro (918 bp) was amplified from the cDNA of the virus by polymerase chain reaction (PCR) and cloned into the pGEM-T vector. 3CLpro was inserted into the expression vector pET28a at the end of the 6 histidine residue encoding sequence to form a fusion protein (6xHis-3CLpro). The 6xHis-3Clpro construct was successfully expressed in E. coli. The expression of 3CLpro was highest when E. coli BL21(DE3) RIL harboring pET28a-3CLpro vector was cultured in LB medium at 20 oC, induced by 1.0 mM Isopropyl thiogalactopyranosie (IPTG) when cell density measured by optical density at 600 nm (OD600) reached 0.7-0.8 and harvested after 24 hours of induction. The recombinant 3CLpro was purified by Ni-sepharose affinity chromatography under denaturation conditions. The purified 3CLpro had a 41 kDa band on sodium dodesyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Western blotting using polyclonal anti-3CLpro antibody and hydrolyzed a fluorescent specific substrate of 3CLpro after renaturation.

TTKHCNQG, CTv 8

Xem toàn văn